Post 25 tagoj da statika inkubacio je 28°C, lakazo de *Pleurotus ostreatus* NRC620 montris la plej altan aktivecon en la funga kulturmedio. La optimumaj pH- kaj temperaturaj valoroj por ĉi tiu enzimo estis 3.0 kaj 70°C, respektive. Post 2 horoj da inkubacio je 40°C kaj 50°C, la enzima aktiveco restis je 68.33% kaj 59.61%, respektive. Post 2 horoj da inkubacio en citrato-fosfata bufro (pH 7.0), la enzima aktiveco restis je 100%. La aldono de 10 mM MgSO₄ kaj CuSO₄ pliigis la enziman aktivecon je proksimume 21% kaj 35%, respektive, dum NaCl, MnCl₂, KCl, kaj CaCl₂ inhibis la enziman aktivecon. Uzante ABTS kiel substraton, la kinetaj parametroj (Km kaj Vmax) de la lakazo *Pleurotus ostreatus* NRC 620 estis 1,99 mM kaj 16 217 μmol min⁻¹ L⁻¹, respektive. Enzima traktado de pomsukaj specimenoj signife reduktis kaj pH kaj viskozecon, kaj ĉi tiu redukto korelaciis kun plilongigo de la stokadotempo. Lakaza traktado rezultigis iometan malpliiĝon de la totala fenola enhavo de pomsuko, sed neniu redukto de la antioksidanta aktiveco estis observita.
En la lastaj jaroj, esploristoj fokusiĝis al la apliko de verda bioteknologio en la nutraĵindustrio. Lakazo estas unu el la plej utilaj enzimoj en la nutraĵindustrio, trovante aplikojn en areoj kiel sukprilaborado, bakado, vinstabiligo kaj plibonigo de la organoleptikaj kvalitoj de nutraĵproduktoj.1Multaj pli altaj plantoj kaj mikroorganismoj sekrecias lakazon,2kaj fungoj kiel deuteromicetoj, askomicetoj kaj bazidiomicetoj ankaŭ povas produkti lakazon.3Lakazo (EC 1.10.3.2) estas blua oksidazo kiu reduktas molekulan oksigenon al akvo uzante sistemon konsistantan el tri malsamaj kupro-atomoj, tiel oksidante diversajn fenolajn kombinaĵojn kaj aromajn aminojn. Dum la produktado de frukto- kaj legomsukoj, enzima kaj neenzima bruniĝo estas kritikaj problemoj.4Ĉar ĉi tiuj substancoj negative influas la koloron, guston kaj aromon de la suko, ili devas esti forigitaj.5
El ĉiuj fruktoj, pomoj estas la plej konsumataj tutmonde kaj en la Eŭropa Unio. En 2019, pomproduktado rangis trie tutmonde, superante 87 milionojn da tunoj.6Pomoj enhavas multajn fenolajn kombinaĵojn, inkluzive de flavonoidoj kaj fenolajn acidojn kiel kafeika acido kaj klorogena acido.7Ĉar pomsuko estas tipe konsumata en sia klara formo, proksimume 50% ĝis 90% de la fenolaj komponantoj perdiĝas dum la filtradprocezo.8Hodiaŭ, konsumantoj emas elekti minimume prilaboritajn produktojn, kiel ekzemple malklaran pomsukon kun alta polifenola enhavo. Tamen, pro ĝia alta fenola enhavo, ĉi tiu tipo de pomsuko estas aparte sentema al miskolorigo kaj malheliĝo.9Diversaj teknologioj, inkluzive de varmotraktadmetodoj kiel pasteŭrizado je 60–90 °C, estas uzataj por redukti aŭ malhelpi malheliĝon de pomsuko.10Tamen, laŭ esploro de Sauceda-Gálvez11, termika prilaborado povas detrui volatilajn kemiaĵojn kaj influi la organoleptikajn kvalitojn de pomsuko. Alternativoj al termikaj prilaboraj metodoj inkluzivas superkritikan karbondioksidon, ultraviolan radiadon, ultrasonon, altan hidrostatikan premon aŭ altpreman homogenigon.12La efikeco de ĉi tiuj teknologioj kaj la rendimento de taŭgaj fruktosukoj dependas de la uzataj parametroj kaj produktaj karakterizaĵoj. Ilia vasta uzo estas limigita de altaj kostoj, malfavoraj efikoj al la kvalito de iuj nutraĵoj, aŭ neadekvata enzima malaktivigo.13,14
Lakazo povas esti uzata por stabiligi kaj klarigi fruktosukon.15Gökmen kaj aliaj.16rekomendas la uzon de lakazo por klarigo de fruktosuko ĉar ĝi efike forigas fenolajn kombinaĵojn konvertante ilin en polimerojn aŭ oligomerojn, kiujn oni facile forigas per iu ajn ultrafiltra membrano, permesante al pomsuko konservi stabilan koloron kaj klarecon ĝis ses semajnoj je 50 °C. Purigita *Trichoderma* lakazo estis senmovigita sur alumino-teraj globetoj kaj uzata por selekteme forigi malgustajn kombinaĵojn kaŭzitajn de mikroba poluado de pomsuko.17
Proksimume 80-90% de la volatilaj komponantoj de pomsuko estas esteroj kaj aldehidoj, kiuj donas unikan aromon al la suko.18Lakazo el *Trametes versicolor* estis senmovigita sur malmultekosta subteno farita el natura fibro de junaj kokosŝeloj por klarigo de pomsuko.19Antaŭaj studoj esploris la stabiligon de pomsuko (koloro kaj neklareco) uzante senenzimajn aŭ senmovigajn metodojn, aŭ en kombinaĵo kun ultrafiltrado.5,19Tamen, la efiko de fungaj lakazoj sur la fizik-kemiajn ecojn de pomsuko dum stokado restas neklara. Tial, la celo de ĉi tiu studo estis eksperimente esplori la ŝanĝojn en la fizik-kemiaj ecoj, enhavo de fenolaj komponaĵoj, kaj antioksida agado de pomsuko post traktado per fungaj lakazoj kaj du-semajna fridiga stokado. Lakazoj havas la kapablon oksidigi fenolajn komponaĵojn, kio igas ilin promesplenaj por uzo en diversaj industriaj procezoj, inkluzive de sukklarigo. Ĉi tiu studo ekzamenis lakazojn de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, enfokusigante la idealajn kondiĉojn por ilia aktiveco kaj efikeco en sukklarigo. Dum esplorado pri ostrofungoj (P. ostreatus NRC 620) estas ankoraŭ limigita, antaŭaj studoj ekzamenis enzimojn el diversaj fungaj fontoj, kiel ekzemple Trametes versicolor kaj Ganoderma lucidum. La celo de ĉi tiu studo estis taksi la eblan aplikon de ĉi tiu enzimo en la nutraĵa industrio kaj elstarigi ĝiajn unikajn ecojn, precipe ĝian idealan pH kaj temperaturon.
2,2′-Azooksibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfona acido) (ABTS) estis aĉetita de Sigma-Aldrich (Kanado). Ĉiuj aliaj reakciaĵoj estis de analiza grado.
La Centro por Kolektado de Mikrobaj Kulturoj de la Nacia Esplorcentro akiris la konatan ostrofungan trostreĉon NRC620. Post subkulturo, ĉi tiu trostreĉo estis konservita sur terpomaj dekstrozaj agarplatoj je 4°C. La metodo de preparado de la inokulo estis jena: 10-taga, plene evoluinta micelio estis inokulita sur terpomaj dekstrozaj agarplatoj kaj inkubaciita je 28°C. Post 10 tagoj, tri 12-mm-diametraj micelaj blokoj estis forigitaj de la agarmedio uzante sterilan metalan stampilon kaj metitaj en 250-ml Erlenmeyer-flakon kun kotonaj ŝtopiloj enhavantaj 50 ml da steriligita kulturmedio (pH 5.0, kiel antaŭe priskribite de Othman et al.20). La kulturoj estis inkubaciitaj je 28 °C dum 18 tagoj. La kulturoj estis poste filtritaj tra Whatman-numero 1 filtropapero, kaj la rezulta supernatanto funkciis kiel la enzimfonto.
Lakaza aktiveco estis determinita uzante ABTS kiel substraton. La reakcia miksaĵo (2 mL) enhavis 500 μL da 0.3 mM ABTS (solvita en 0.1 M natria citrata bufrosolvaĵo, pH 4.5) kaj la bezonatan kvanton da enzima specimeno diluita per distilita akvo.21,22Konsiderante, ke lakazo povas oksidigi ABTS je ĉambra temperaturo (28 °C ± 2), ABTS-oksidiĝo estis determinita per mezurado de la pliiĝo de absorbado je 420 nm (ε420= 36,000 cm³-1 M -1) uzante Agilent Carry-100 UV-spektrofotometron. Unu unuo de lakaza aktiveco estis necesa por oksidigi 1 μmol da ABTS minute. Proteina koncentriĝo estis determinita per la metodo de Bradford uzante bovan seruman albuminon kiel internan kontrolon.23,24
Post akiro de la enzimo el la ostrofunga trostreĉiĝo NRC 620, ĝia aktiveco estis mezurita je malsamaj kultivintervaloj dum 25 tagoj sub senmovaj kondiĉoj je 28 °C.
Por studi la efikon de temperaturo sur la lakaza aktiveco, eksperimentoj estis faritaj en la temperaturintervalo de 20 ĝis 90 °C. Antaŭ ol aldoni la enzimon kaj komenci la reakcion, la bufro (0.1 M natria citrato, pH 4.5) kaj substrato (ABTS) estis miksitaj kaj inkubaciitaj dum 5 minutoj je diversaj temperaturoj. La termika stabileco de la enzimo estis taksita per inkubacio en 0.05 M natria fosfata bufro (pH 7.0) je 40, 50, 60 kaj 70 °C dum 2 horoj, respektive. La resta aktiveco estis poste taksita uzante la ABTS-substraton.
La efiko de pH sur la lakaza aktiveco estis taksita uzante ABTS kiel substraton en 0.1 M citrato-fosfataj bufroj kun pH-intervalo de 2.5 ĝis 7.0. La enzima solvaĵo estis inkubita je 40 °C dum du horoj en 0.1 M citrato kaj Tris-bufroj (pH 3, 4, 6, kaj 7) por taksi pH-stabilecon. Resta aktiveco kun ABTS kiel substrato estis kalkulita post inkubacio.
La lakazo estis inkubaciita dum 10 minutoj en bufro de natria fosfato (0,05 M, pH 7,0) enhavanta diversajn metaljonojn (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, kaj Mn2+) je koncentriĝoj de 2,5 mM kaj 10 mM, respektive. La substrato (ABTS) estis poste aldonita por komenci la reakcion, kaj la relativa aktiveco estis taksita.
ABTS-oksidiĝo per lakazo je diversaj koncentriĝoj (0,025–3 mM) estis mezurita je pH 4,5 por determini la kinetikajn parametrojn (Vmax kaj Km). La kinetakonstantojde la ekvacio de Michaelis-Menten estis kalkulitaj uzante Lineweaver-Burk-diagramon, kiu reprezentas la inverson de la reakcia rapido kiel funkcion de substrata koncentriĝo. La kinetaj konstantoj estis kalkulitaj el la Lineweaver-Burk-diagramo uzante la programaron GraphPad Prism versio 6.01.
Post zorgema lavado de la pomoj per krana akvo, ili estis duonigitaj kaj sukigitaj per plene aŭtomata pompremilo Braun MP80 (fabrikita en Germanio). La suko estis filtrita tra kvar tavoloj de fromaĝtuko. Neniuj enzimoj estis aldonitaj al la kontrolgrupo, dum 2.0% da lakazo (la plej efika koncentriĝo testita) estis aldonita al freŝe preparita pomsuko, kiu poste estis konservita je 4°C dum du semajnoj.
Titrebla acideco (TA) kaj pH estis determinitaj laŭ la metodo de Boulton et al.al.27La pH de ĉiu specimeno estis mezurita per cifereca pH-mezurilo (JENWAY 3510 pH-mezurilo). Titrebla acideco (TA) estis kalkulita surbaze de malata acido uzante la jenan formulon.
Kie V kaj C estas respektive la volumeno (mL) kaj koncentriĝo (0,1 mol/L) de la natria hidroksida solvaĵo uzata en la titrado. K estas la konverta koeficiento de la malata acido, egala al 0,067, kaj W estas la maso (g) de pomsuko.
La totalaj solveblaj solidoj (TDS) enhavo de ĉiuj sukspecimenoj estis determinita per poŝa refraktometro PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japanio). Post ĉiu mezurado, la optika lenso estis ellavita per dejonigita akvo, kaj ĉiu pomsuka specimeno estis testita tri fojojn. La valoro por ĉiu specimeno estis kalkulita per averaĝado de la tri mezuradoj. La meznombro ± norma devio por ĉiu pomsuka specimeno ankaŭ estis kalkulita per averaĝado de ĉi tiuj rezultoj.
La viskoelasteco de la pomsukaj specimenoj estis taksita per rotacia viskozimetro (RV, Rheotest 2, Germanio). La specimeno estis metita en la cilindron "S2" de la viskozimetro. La ŝajna viskozeco estis reprezentita per la deklivo de la kurbo de ŝerstreĉo kontraŭ ŝerrapideco, kiu estis kalkulita el la ŝerstreĉo kaj la respondaj kurboj ĉe diversaj ŝerrapidecoj (de 1,00 ĝis 437,4 s⁻¹). La formulo por kalkuli la ŝajnan viskozecon estas jena:
Kie η estas la ŝajna viskozeco (cP), τ estas la ŝerstreĉo (dinam/cm²), γ estas la ŝirrapideco (sek⁻¹), kaj (τ) estas kalkulita uzante la valorojn de la tordmomanto (α) kaj cilindro (Z) uzante la jenan formulon: τ = Z . α.
La bruniga indico estis determinita laŭ la metodo de Meidav kajal.2910-ml suko-specimeno estis centrifugita je 2750 xg dum 10 minutoj. 5 ml da la suko-supernatanto estis miksita kun 5 ml da 95%-etanolo. La absorbado de la miksaĵo estis mezurita je 420 nm uzante Shimadzu UV-spektrofotometron (UV-1601 PC).
La totala fenola enhavo (TPC) estis determinita kolorimetrie uzante la reakciilon Folin-Ciocalteu kiel priskribite de Boulton et al.[27]. Normkurbo de gala acido estis konstruita por koncentriĝoj de 0 ĝis 500 mg/L (r²= 0,997). Rezultoj estas esprimitaj kiel galacidaj ekvivalentoj (mg GAE/mL).
Aldonu 125 μL da distilita akvo kaj 2850 μL da FRAP-solvaĵo al 25 μL da pomsuko kaj lasu la miksaĵon en la mallumo dum30min. Poste mezuru la absorbadon je 593 nm uzante Shimadzu UV-spektrofotometron (UV-1601 PC). La FRAP-reakciaĵo estis preparita miksante 300 mM acetatan bufran solvon (pH 3.6), 20 mM feran(III) kloridon, kaj 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazinon (TPTZ) (solvitan en 40 mM HCl) en proporcio de 10:1:1. Normkurbo estis generita uzante Trolox kiel la normon (R²= 0,999), kaj la rezultoj estas esprimitaj kiel μM Trolox/mL.
La antioksidanta aktiveco de la traktitaj kaj netraktitaj sukoj estis determinita uzante la DPPH-metodon por taksi ilian kapablon forigi DPPH-liberajn radikalulojn.31Dek mikrolitroj da suko estis miksitaj kun 1 ml da DPPH-solvaĵo (100 μM) en metanolo. Post reakcio en mallumo dum 30 minutoj, la absorbado de la miksaĵo estis mezurita je 517 nm uzante Shimadzu UV-spektrofotometron (UV-1601 PC). La rezultoj estis esprimitaj kiel troloksaj ekvivalentoj (μM trolokso/ml) bazitaj sur kalibrada kurbo (R2= 0,990).
La akiritaj datumoj montris, ke maksimuma lakaza produktado estis observita en NRC 620 ostrofungoj antaŭ la fino de la 18-a tago de fermentado, atingante aktivecon de 1302 U/L. Ĉi tio funkciis kiel bazo por determini la optimuman kultivtempon por lakaza produktado (Figuro 1). Kvankam enzima produktado pliiĝis kun kreskanta kultivtempo, la kreskorapideco ne estis rekte proporcia al kultivtempo; post 21 tagoj, enzima aktiveco pliiĝis nur je 90 U/L (ĝis 1390 U/L). Tial, 18 tagoj estis finfine elektitaj kiel la optimuma kultivtempo por balanci la produktorendimenton kun la ekonomiaj avantaĝoj de pliigita kultivtempo.
Efiko de kultivtempo sur la lakaza rendimento en Pleurotus ostreatus NRC 620. Tri (12 mm) fungaj micelblokoj estis inokulitaj en 50 ml da sterila medio kaj poste kultivitaj je 28 °C dum malsamaj tempoj.
Kongrue kun aliaj studoj, niaj rezultoj indikas, ke la ideala kulturperiodo por atingi pintan lakazsekrecion fare de fungoj verŝajne estas inter 7 kaj 36 tagoj.32Laŭ Ezike kaj aliaj.33*Trametes polyzona* WRF03 produktis la plej altan kvanton da lakazo antaŭ la fino de la naŭa tago de fermentado, kun specifa aktiveco de 1637 U/mg da proteino. Krome, Othman et al.34trovis, ke *Trichoderma harzianum* S7113 sekreciis grandan kvanton da lakazo en la kvina tago de la kultivado. La lakaza produktado atingis pintan aktivecon en la dek-kvara tago kaj poste iom post iom malpliiĝis.34Kvankam enzima sekrecio ankaŭ povas okazi dum la ĉefa kreskofazo, ĝi kutime pintas dum la meza fazo kaj estas ekigita per la konsumo de karbona aŭ nitrogena fonto.34,35
Kvankam lakazo de Pleurotus ostreatus NRC 620 montris altan aktivecon trans larĝa temperaturintervalo de 50°C ĝis 80°C, preskaŭ al pinta aktiveco (69–98%), ĝia maksimuma aktiveco estis observita je 70°C (Fig. 2a). Ekster ĉi tiu temperaturintervalo, enzima aktiveco malpliiĝis je proksimume 70°C. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke la enzimo estas aktiva je altaj temperaturoj, verŝajne ĉar alta temperaturo pliigas la kinetikan energion de la reakcio.
Efiko de reakcia temperaturo (a) kaj pH (b) sur la lakaza aktiveco en *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturoj intervalantaj de 20 ĝis 90 °C estis atingitaj per antaŭinkubado de la miksaĵo je malsamaj temperaturoj dum 5 minutoj antaŭ aldono de la enzimo kaj komenco de la reakcio. La efiko de pH sur la lakaza aktiveco estis taksita uzante ABTS kiel substraton en solvaĵoj enhavantaj 0.1 M citrato-fosfatan bufron super pH-intervalo de 2.5 ĝis 7.0.
Laŭ Ezike kajal.33, la optimuma temperaturo por *Trametes polyzona* WRF03-lakazo estas 55 °C, kiu estas la sama kiel tiu por *Ganoderma lucidum*lakazo36kaj simila al la optimuma temperaturo (50 °C) por *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakazo . Baldrian38notas ke, kiel por aliaj lignin-malkonstruantaj enzimsistemoj, la ideala temperaturintervalo por lakazo estas inter 50 kaj 70 °C.
La rezultoj montris, ke la enzimo montris la plej altan aktivecon je pH 3.0, atingante 94% je pH 3.5. Tamen, ĝi restis aktiva en larĝa pH-intervalo de 2.5 ĝis 7.0 (Figuro 2b). Krome, ĝi montris pli altan aktivecon en acidaj kondiĉoj kompare kun neŭtralaj aŭ alkalaj kondiĉoj. Ĝia aktiveco restis almenaŭ 77% en la pH-intervalo de 2.5 ĝis 4.5, sed atingis nur ĉirkaŭ 38% je pH 7.0. La optimuma pH por lakazo de *Trametes polyzona* WRF03 estis 4.533, kio estas la sama kiel la pH por lakazoj de *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, kaj *Trametes hirsuta* 41. Tamen, laŭ la studo de Chairin et al.42, la optimuma pH por lakazo de *Polymorpha f. sp.* WR710-1 estas 2.2, dum la optimuma pH por lakazo de *Polymorpha f. sp.* IBL-04 estas 5.043. La ligado de hidroksidaj anjonoj (lakaza inhibiciilo) al la kupraj atomoj de T2/T3-lakazo povas esti la kialo de la malpliiĝinta lakaza aktiveco sub neŭtralaj aŭ alkalaj pH-kondiĉoj. Ĉi tio povas interrompi la internan elektronan translokigon de la T1-centro al la T2/T3-centro, tiellimigantala enzima aktiveco23,44
Per kovado de la enzimo je malsamaj temperaturoj, oni trovis, ke kaj la inkubacia tempo kaj la temperaturo influis la stabilecon de la enzimo. Rimarkinde, lakazo de *Trametes polyzona* NRC 620 montris pli altan stabilecon je 40℃ kaj 50℃, retenante 68,33% kaj 59,61% de sia komenca aktiveco, respektive, post 120 minutoj (Figuro 3a). Kontraste, sub la samaj kondiĉoj (40℃ kaj 50℃, 120 minutoj), lakazo de *Trametes polyzona* WRF03 retenis 64,38% kaj 42,92% de sia aktiveco, respektive.33Male, pliigo de la inkubacia tempo kaj temperaturo malpliigis la stabilecon de la lakazo *Trametes polyzona* NRC 620; Post inkubacio je 60℃ kaj 70℃ dum 60 minutoj, ĝia aktiveco malpliiĝis al 39,24% kaj 1,72%, respektive (Figuro 3a). Konforme al la eksperimentaj rezultoj, la lakazo de *Trametes polyzona* WRF03 montris pli altan stabilecon je 40 kaj 50℃ dum la tuta termika traktadprocezo.33Simile, Lueangjaroenkit kajal.37kaj Chairin kaj aliajal.42raportis la stabilecon de lakazoj de Trametes polyzona KURNW027 kaj Trametes polyzona WR710-1 je 50 °C dum 1 horo, respektive. Kiel utila biokatalizilo aplikebla en diversaj bioteknologiaj kampoj, lakazo devus havi bonan stabilecon kaj rendimenton super larĝa temperaturintervalo.
Termostata stabileco (a) kaj pH-stabileco (b) de lakazo el *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostata stabileco estis taksita per inkubado de la enzima solvaĵo en 0.05 M natria fosfata bufro (pH 7.0) je 40, 50, 60, kaj 70 °C dum 2 horoj, respektive. pH-stabileco estis taksita per inkubado de la enzima solvaĵo en 0.1 M citrata bufro kaj Tris-bufro (pH 3, 4, 6, kaj 7) je 40 °C dum 2 horoj. Resta aktiveco estis kalkulita uzante ABTS kiel substraton post inkubado.
Por determini la optimumajn kondiĉojn por enzima uzo kaj stokado, ni esploris la efikon de pH sur la stabilecon de lakazo. Eksponiĝo al malsamaj pH-valoroj signife influis la stabilecon de la proteina strukturo, tiel influante la stabilecon kaj aktivecon de la enzima molekulo. La rezultoj montris, ke la enzimo estis malpli stabila sub acidaj kondiĉoj, dum ĝi montris pli bonan stabilecon ĉe pli altaj pH-valoroj (neŭtralaj kaj alkalaj regionoj). Ĉe pH-valoroj de 7.0, 6.0, 4.0 kaj 3.0, la enzimaj retenrapidecoj post 120 minutoj estis proksimume 100%, 62.54%, 52.39% kaj 11.14%, respektive (Fig. 3b). *Strombus multisus* WRF03-lakazo montris pli altan stabilecon ĉe neŭtralaj pH-valoroj (5.5–6.5) kaj pli malaltan stabilecon ĉe acidaj pH-valoroj (sub 4.0). Post 120 minutoj ĉe pH-valoroj de 5,5, 6,0 kaj 6,5, la enzimaj retenrapidecoj estis proksimume 82%, 100% kaj 93%, respektive.33Ĥairin kaj aliaj.42notis, ke lakazo de Trametes polyzona WR710-1 estis stabila en la pH-intervalo de 6,0 ĝis 7,0, dum Sayed et al.45montris, ke lakazo estis pli stabila sub neŭtralaj pH-kondiĉoj. Tamen, lakazo de Cerrena unicolor ankaŭ montris stabilecon sub alkalaj kondiĉoj (pH 9.0)46La studitaj lakazoj montris altan stabilecon super larĝa pH-intervalo. Ĉi tio povas esti grava karakterizaĵo por industriaj aplikoj.
Ĉar iuj metaljonoj havas kaj stimulajn kaj inhibiciajn efikojn sur enzima aktiveco, iliaj efikoj sur enzima aktiveco devas esti konsiderataj en industriaj aplikoj. Ĉi tio estas decida ĉar metaljonoj estas oftaj mediaj poluaĵoj, kiuj povas influi la stabilecon kaj sintezon de eksterĉelaj enzimoj.47Por esplori la efikojn de pluraj metaljonoj sur lakazo de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, ni faris respondajn eksperimentojn. Kiel montrite en Figuro 4, depende de la tipo de uzita metalo, pliigo de la metaljona koncentriĝo de 2.5 mM ĝis 10 mM negative influis la enziman funkcion. Ekzemple,Mg²⁺ , Ko²⁺ , Zn²⁺, kajCu²⁺povus stimuli kaj aktivigi la enziman aktivecon, dumNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, kajK⁺povus inhibicii la enziman aktivecon. Ĉe koncentriĝo de 10 mM, Cu²⁺ kaj Mg²⁺ jonoj estis la plej potencaj aktivigiloj de lakaza aktiveco de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, provizante aktivigan gradon de proksimume 34% kaj 20%, respektive. Tamen, ĉe koncentriĝo de 10 mM, Ca²⁺ jonoj estis la plej potenca inhibiciilo de lakazo, reduktante enziman aktivecon je proksimume 60%.
La efiko de metaljonoj sur la aktiveco de Pleurotus ostreatus NRC 620 lakazo. La lakazo estis inkubaciita dum 10 minutoj en natria fosfata bufro (0.05 M, pH 7.0) enhavanta diversajn metaljonojn je koncentriĝoj de 2.5 mM kaj 10 mM. La reakcio estis poste komencita per aldono de la substrato (ABTS), post kio la relativa aktiveco estis mezurita.
Niaj rezultoj kongruas kun tiuj de aliaj aŭtoroj, kiuj trovis, ke Mg²⁺ kaj Cu²⁺ plifortigas la aktivecon de *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ trovis, ke lakazo de *Xylaria* sp. estas iagrade stimulita per kuprojonoj (Cu²⁺). Krome, Foroutanfar et al.⁴⁹ kaj Si et al.⁵⁰ faris similajn studojn pri lakazoj de *Paraconiothyrium variabile* kaj *Trametes pubescens*, respektive. La tipo II kupro-liga loko (T2) de ĉi tiu enzimo povas esti saturita per Cu²⁺ je difinita koncentriĝo, kio povas klarigi la stimulon de lakaza aktiveco je pli altaj Cu²⁺³⁹ koncentriĝoj. Ĉar la lakazoj de blanka putrofungoj estas oksidazoj enhavantaj plurajn kupratomojn, la efikoj de kupraj jonoj sur lakaza aktiveco estas diversaj kaj varias de stimulaj kaj inhibiciaj ĝis neŭtralaj.⁵¹ Kontraste, Zhou et al.[52]raportis keCu²⁺inhibis la lakazan aktivecon de tajvana subtera termito (Odontotermes formosanus). Tamen, lakazoj de Cerena sp. HYB07[53]kaj Clitocybe maxima[54]ne estis trafitaj de kupraj jonoj.
La substrata specifeco estis reprezentita per ĝiaj kinetaj parametroj (Km kaj Vmax); ju pli forta la liga afineco de la substrato al la enzimo, des pli malalta la Km-valoro kaj des pli alta la substrata specifeco.3,21,55La kinetaj parametroj (Km kaj Vmax) de lakazo el *Pleurotus ostreatus* NRC 620 estis determinitaj per la programaro GraphPad Prism 6.0 per desegnado de la Lineweaver-Burk-diagramo (Figuro 5). Uzante ABTS kiel substraton, la rezultoj estis 1,99 mM kaj 16217 μmolmin⁻¹ L⁻¹,respektive. Elsayed kaj aliaj.21raportis, ke la Km-valoroj por ABTS-oksidiĝo estis 0,1 mM kaj 0,064 mM, respektive, indikante altan afinecon de Lac A kaj Lac B izoenzimoj por ABTS. Krome, la Vmax-valoroj estis 0,182 μmolmin⁻¹kaj 0,603 μmolmin⁻¹, respektive. La akirita Km-valoro estis pli malalta ol tiu de Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); krome, ilia Vmax-valoro (1429 mmol min⁻¹) ankaŭ estispli malaltakiam oni uzas ABTS kiel substraton.33 Simile, la Km-valoroj de la lakazaj koncentriĝoj de Lentinus squarrosulus MR13 kaj Trametes sp. AH28-2 estis 0,0714 mM kaj 0,025 mM, respektive, kaj la Vmax-valoroj estis 0,0091 mM min−1 kaj 0,67 mM min−1 mg−1 (relative al ABTS), respektive.56,57
La efiko de ABTS-koncentriĝo sur la aktiveco de lakazo el *Pleurotus ostreatus* NRC 620 estis esplorita, kaj Lineweaver-Burk-diagramo de la inverso de la komenca reakcia rapido kontraŭ ABTS-koncentriĝo estis desegnita. La oksidiĝa reakcio de ABTS kun malsamaj koncentriĝoj (0.025–3.0 mM) de lakazo estis mezurita je pH 4.5 por determini la kinetikajn parametrojn (Vmax kaj Km). La kinetikaj konstantoj de Michaelis-Menten estis kalkulitaj uzante la Lineweaver-Burk-diagramon de la inverso de la reakcia rapido kontraŭ la substrata koncentriĝo. La kinetikaj konstantoj estis kalkulitaj el la Lineweaver-Burk-diagramo uzante la programaron GraphPad Prism 6.01.
Tradiciaj klarigaj enzimoj, kiel pektinazoj, hidrolizas pektajn substancojn, reduktante viskozecon kaj neklarecon. Ili efike malkomponas strukturajn polisakaridojn kaj ofte estas uzataj kune kun aliaj enzimoj, kiel celulazoj kaj hemicelulazoj, por plibonigi rendimenton kaj klarecon. Tamen, pektinazoj ne specife celas fenolajn kombinaĵojn, kiuj estas la ĉefaj kontribuantoj al neklareco kaj oksidativa bruniĝo, precipe en sukoj kiel pomosuko kaj vinbersuko.58Kontraste, lakazoj katalizas la oksidiĝon de fenolaj kombinaĵoj, polimerigante ilin en pli grandajn, nesolveblajn molekulojn, kiuj povas esti forigitaj per sedimentado aŭ filtrado. Ĉi tiu mekanismo ne nur plibonigas klarecon, sed ankaŭ plilongigas la konserveblecon de suko reduktante la probablecon de oksidativa bruniĝo kaŭzita de fenolaj kombinaĵoj. Krome, lakazaj klarigprocezoj povas esti efektivigitaj sub mildaj prilaboraj kondiĉoj (pH 3,5–5,5, temperaturo 25–40 °C), igante ilin taŭgaj por delikataj sukoj sen kompromiti iliajn nutrajn aŭ organoleptikajn ecojn.59Studoj montris, ke pektinaza traktado povas klarigi sukon en 1-2 horoj, dum lakaza traktado tipe postulas pli longan reagtempon (3-6 horoj) por tute redukti fenolajn kombinaĵojn. Tamen, ĉi tiu procezo povas esti optimumigita per senmovigado de la enzimo aŭ per kombinado de lakazo kun mekanikaj klarigaj metodoj.60En ĉi tiu studo, enzima profilado de la kruda ekstrakto rivelis signifajn lakazajn kaj α-amilazajn aktivecojn, dum pektinazaj kaj ksilanazaj aktivecoj estis ekstreme malaltaj, kaj celulaza aktiveco ne estis detektita. Tial, la redukto de neklareco kaj fenola enhavo ŝuldiĝis ĉefe al la ago de lakazo, dum la ŝanĝo en viskozeco povus esti parte pro la ago de amilazo.
Tabelo 1 montras la fizik-kemiajn parametrojn de freŝe premita pomsuko kaj lakazo-traktitaj specimenoj. La rezultoj montris, ke la rendimento de freŝe premita pomsuko (71,59%) estis pli malalta ol tiu de lakazo-traktitaj specimenoj (87,34%). Ĉi tiuj rezultoj kongruas kun la trovoj de Pilnik kaj Orange.61, kiu indikis, ke la uzo de enzimoj en fruktoprilaborado povas pliigi la sukorendimenton, plibonigi la filtradon kaj akiri altkvalitan, klaran sukon por koncentriĝo. La pliiĝo de la sukorendimento ŝuldiĝas ĉefe al la pliiĝo de la enhavo de solveblaj sukeroj en la suko. Dum enzima hidrolizo de fruktoj, mezogleo kaj pektino en la ĉelmuroj de la produkto estas detruitaj kaj konvertitaj en solveblajn substancojn kiel neŭtralajn sukerojn kaj acidojn.62.La pH-valoro de la enzime traktita pomsuko estis signife pli malalta ol tiu de la kontrolgrupo (P < 0,05), kaj la pH-valoro de ambaŭ grupoj signife pliiĝis dum stokado (Tabelo 1). Ĉi tiuj rezultoj kongruas kun tiuj de Mark et al.63, kiu rimarkis, ke la pH de akaĵua fruktosuko malpliiĝis post stokado post varmotraktado. Pektina degradiĝo kaj galakturonata acidoformado post enzima traktado povas esti respondecaj pri la pliiĝo de pH dum stokado. La pH de enzime traktitaj specimenoj restis inter 4,05 kaj 4,31 dum la tuta stokado, dum la pH de netraktita pomsuko variis inter 4,12 kaj 4,33.
La totala acideco (TA) de kaj netraktitaj kaj lakaze traktitaj specimenoj montris malkreskantan tendencon kun kreskanta stokadotempo (Tabelo 1). La malpliiĝo de acideco estis atribuita al la konverto de organikaj acidoj al karbonhidratoj aŭ enzimaj reakcioj, same kiel oksidiĝo dum sukostokado.64La totala acideco de la kontrola pomsuko kaj enzime traktitaj specimenoj estis pli malalta ol tiu de aliaj sukoj (fragosuko 0,9%, prunsuko 2,2%, kumkvatsuko 1,0%, abrikotsuko 2,4%, oranĝsuko 0,8%), sed simila al tiu de aliaj sukoj (ekz., pirsuko 0,3%).62Ĉi tiuj diferencoj en netraktita freŝe premita pomsuko povas ŝuldiĝi al diversaj faktoroj kiel kreskkondiĉoj, genetikaj faktoroj, maturecnivelo kaj prilaboraj metodoj.65La malpliiĝo de totala acideco de kontrola kaj lakaze traktita pomsuko kongruas kun la rezultoj prezentitaj de Singh et al.66rilate al la malpliiĝo de la totala acideco de la pomsuko de Jin Nuo post 74 tagoj da stokado. Aliflanke, Oshmiansky kaj Wojdylo67ne trovis iujn ajn signifajn ŝanĝojn en la acideco de pomsuko studante la efikon de tradiciaj klarigaj metodoj.
La rezultoj prezentitaj en Tabelo 1 indikas, ke la valoro de totalaj solveblaj solidoj (TSS) de la lakaze traktita pomsuko estis pli alta ol tiu de la netraktita specimeno. Ĉi tiuj rezultoj kongruas kun la publikigitaj studoj.. 68Plue, Tabelo 1 montras, ke la TSS-valoro de la kontrola pomsuka grupo estis 9,58 ĉe la komenca tempopunkto kaj atingis 11,05 antaŭ la fino de la stokadoperiodo. Ĉi tiuj valoroj estas pli malaltaj ol la TSS-valoroj de freŝa pomsuko raportitaj de Hamid et al.. 69(11,2 kaj 11,80, respektive). La valoro de TSS (kompleta sumo de solidoj) de la per lakazo traktitaj pomsukaj specimenoj signife pliiĝis, komencante de 11,23 kaj atingante 12,93 post du semajnoj da stokado je 4 °C (Tabelo 1). Simila pliiĝo de TSS dum stokado estis observita ankaŭ en citrusfruktoj, citronoj kaj dolĉaj oranĝoj. La pliiĝo de totalaj solveblaj solidoj (TSS) dum stokado povas ŝuldiĝi al la hidrolizo de polisakaridoj (amelo) al monosakaridoj (sukeroj), la pliiĝo de koncentriĝo pro sukdehidratiĝo, kaj la putriĝo de pektino en la suko al solveblaj solidoj. La pliiĝo de totalaj solveblaj solidoj (TSS) verŝajne ŝuldiĝas al la pliiĝo de solveblaj sukeroj, kiuj povas esti formitaj per la konverto de pektino aŭ celulozo al solveblaj sukeroj per pektino aŭ celulazo, respektive, aŭ per la hidrolizo de amelo al sukeroj, kiel raportite de Hamed et al.69.La efiko de lakazo sur la ecoj de pomsuko observeblas vide, ĉar lakazo-traktita pomsuko montras pli bonan flueblecon kaj pli malaltan viskozecon ol netraktita suko. Ĉi tiu observado estas registrita en Tabelo 1; La viskozeco de la enzime-traktita specimeno estis 1,87 cP, dum la viskozeco de la kontrolspecimeno estis 2,95 cP. Ĉi tiu signifa malpliiĝo de viskozeco verŝajne ŝuldiĝas al la pli alta akvo-tenkapacito de pektin-similaj substancoj kaj la formado de kohera retstrukturo.
En ĉi tiu studo, la efiko de lakazo sur la bruniĝindekso (BI) de pomsuko estis esplorita per mezurado de la absorbado je 420 nm uzante spektrofotometron. La rezultoj estas montritaj en Tabelo 1. Dum stokado, la BI de pomsukaj specimenoj en ambaŭ traktitaj kaj netraktitaj grupoj montris laŭgradan kreskantan tendencon. BI reflektas la gradon de bruniĝo kaj povas servi kielgravaindikilo de enzimaj kaj neenzimaj bruniĝaj reagoj. La absorbado signife pliiĝis dum stokado (P < 0,05). Ĉe la fino de stokado, laA420La valoro de pomsukaj specimenoj en la kontrola kaj enzime traktita grupoj pliiĝis je ĉirkaŭ 217% kaj 121%, respektive (Tabelo 1). La rezultoj indikas, ke enzima traktado povas efike redukti la bruniĝgradon je ĉirkaŭ 56%. La rezultoj de Bezerra et al.[19] kongruas kun niaj rezultoj; Ili uzis lakazo-glutaraldehido-kokosfibrojn por klarigi pomsukon, reduktante ĝian originalan koloron je 61%.
Kvankam polifenoloj en fruktosukoj havas pozitivajn nutrajn kaj terapiajn efikojn sur la homan korpon, ili ankaŭ povas reagi kun proteinoj, kaŭzante suknebulecon, sedimentadon aŭ malklarecon, tiel ŝanĝante la guston kaj aromon de la produkto kaj mallongigante ĝian bretovivon.71La celo de ĉi tiu studo estis sekure redukti la enhavon de fenolaj komponaĵoj en pomsuko uzante lakazon de Pleurotus ostreatus NRC 620. La rezultoj prezentitaj en Tabelo 1 montras, ke la totala enhavo de fenolaj komponaĵoj en lakaz-traktita pomsuko estis signife reduktita antaŭ stokado je 4 °C. Krome, la totala enhavo de fenolaj komponaĵoj ankaŭ malpliiĝis dum stokado en ambaŭ studitaj specimenoj (Tabelo 1). Esploro de Sandri et al.72montris, ke enzime traktita pomsuko povas konservi sian antioksidan agadon kaj enhavon de fenolaj komponaĵoj. Tamen, la rezultoj de studo de Lettera et al.73montras, ke traktado de oranĝa suko per funga lakazo povas redukti la enhavon de fenolaj komponaĵoj en ĝi je ĝis 45%.
Fenolaj kombinaĵoj montriĝis havi ecojn kiel ekzemple liberaj radikalaj forigo, unuopaĵo-oksigena redukto kaj sensoifigo, hidrogenatoma transdono, kaj elektrona donaco al liberaj radikaluloj, igante ilin potencaj antioksidantoj.74Tial, en ĉi tiu studo, oni uzis metodojn bazitajn sur DPPH kaj FRAP por taksi la efikon de lakazo sur la antioksidan agadon de pomsuko konservita en fridujo dum 14 tagoj (Tabelo 2). Ambaŭ metodoj montris pliiĝon de la antioksida agado dum konservado, kio eble ŝuldiĝas al la pliiĝo de liberaj fenolaj kombinaĵoj aŭ la formado de Maillard-reakciaj produktoj (MRP-oj), kun Maillard-reakciaj produktoj verŝajne estantaj la kaŭzo de la pliiĝo de la antioksida agado.75Ne-enzimaj bruniĝaj reagoj (inkluzive de askorbata acido-degradado, Maillard-reakcioj, kaj acid-katalizita degradado de sukeroj) produktas brunajn pigmentojn (melanoidinojn). Mezaj askorbatacidaj degradproduktoj kaj sukeraj degradproduktoj (kiel ekzemple karbonilaj kombinaĵoj) povas reagi kun aminoacidoj per Maillard-reakcioj.76Kvankam bruniĝo de fruktoj kaj legomoj dum stokado estis amplekse studita, nia kompreno pri ĉi tiuj reagoj restas limigita.77Kompare kun la FRAP-metodo, lakaz-traktita pomsuko montris signife pli malaltan antioksidan agadon per la DPPH-metodo (Tabelo 2), kaj la antioksida agado de ĉiuj specimenoj signife pliiĝis kun kreskanta stokadotempo. Du malsamaj metodoj por determini antioksidan agadon estis uzitaj en ĉi tiu studo ĉar iliaj principoj malsamas. La DPPH-metodo mezuras la kapablon neŭtraligi liberajn radikalulojn, dum la FRAP-metodo mezuras la kapablon redukti ferajn jonojn. Tial, estas rekomendinde uzi plurajn metodojn por determini antioksidan agadon por pli bone kompreni la antioksidan agadon de la studitaj specimenoj.78
Unu el la ĉefaj rezultoj de ĉi tiu studo estas, ke la lakazo *Pleurotus ostreatus* NRC 620 montras optimuman aktivecon je 70 °C kaj pH 3.0. Kompare kun aliaj fungaj lakazoj ofte uzataj por sukklarigado, kiel ekzemple la lakazoj *Trametes versicolor* kaj *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 montras pli altan termikan stabilecon kaj pli acidan pH. Lakazoj de *Trametes versicolor* kaj *Ganoderma lucidum* tipe montras optimuman aktivecon en la intervalo de 50-60 °C kaj je pH-valoroj inter 3.5 kaj 5.0. Ĉi tiu diferenco povas kontribui al plibonigita efikeco de sukklarigado, precipe por acidaj sukoj, kie stabileco je pli malaltaj pH-valoroj estas kritika. La unika karakterizaĵo de *P.* Kompare kun aliaj studitaj fungaj lakazoj, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 montras la kapablon funkcii efike sub pli malfacilaj kondiĉoj. Ĝia pli alta optimuma agadtemperaturo sugestas eblajn avantaĝojn en industriaj aplikoj, kiel ekzemple pli rapidaj reakciaj rapidoj kaj reduktita mikroba poluado. Ĝia malalta pH, kiu bone taŭgas por la acida naturo de multaj sukoj, povus esti utila en sukklarigaj procezoj. Ĉi tiuj rezultoj pravigas plian esploradon por grandskala apliko, igante *Pleurotus ostreatus* NRC 620 realigebla alternativo al tradiciaj fungaj lakazaj fontoj. Kompare kun antaŭaj studoj, ni trovis, ke la optimuma temperaturo estas 60°C kaj la optimuma pH estas 3.0. Post reakcio je 60°C dum 80 minutoj, *Ganoderma lucidum* lakazo retenis...46% de ĝia aktiveco.79 Laŭ Kurniawati kaj Nicelle80La enzimoj de *Ganoderma lucidum* montras bonegan ĝis moderan stabilecon je 25 °C kaj pH-valoroj variantaj de 5.0 ĝis 8.0, kaj stabilecon je pH 6.0 kaj temperaturoj variantaj de 10 ĝis 30 °C. En ĉi tiu studo, ni trovis, ke la optimumaj pH kaj temperaturo por enzima aktiveco por *Pleurotus ostreatus* estis 3.0 kaj 70 °C, respektive. Post inkubacio je 40 °C kaj 50 °C dum du horoj, la enzimo retenis 68.33% kaj 59.61% de sia aktiveco, respektive. Krome, la lakazo de Pleurotus ostreatus NRC 620 montris altan aktivecon trans larĝa temperaturintervalo de 50 °C ĝis 80 °C, preskaŭ atingante maksimuman aktivecon (69%–98%), kun maksimuma aktiveco observita je 70 °C.
Konklude, la lakazo de ostrofungo NRC620, akirita sub statikaj kondiĉoj, montris optimuman aktivecon kaj stabilecon trans gamo da pH- kaj temperaturaj kondiĉoj, montrante superan stabilecon kompare kun aliaj enzimaj fontoj. La aldono de 10 mM MgSO₄ kaj CuSO₄ pliigis la enziman aktivecon je proksimume 21% kaj 35%, respektive. Kiam prilaborita en pomsukon, la enzimo reduktis la pH kaj viskozecon, dum la fenola enhavo malpliiĝis nur iomete dum stokado.
La rezultoj konfirmas la potencialon de lakazo en la nutraĵindustrio, precipe en trinkaĵklarigado. Per specifa malkomponado de fenolaj kombinaĵoj, lakazo ne nur reduktas neklarecon kaj plibonigas klarecon, sed ankaŭ konservas la kvaliton de fruktosukoj sub mildaj funkciaj kondiĉoj. Male al tradiciaj klarigaj agentoj kiel gelateno, bentonito kaj silika ĝelo, lakazo ne generas rubon aŭ forigas agrablajn aromojn el trinkaĵoj, igante ĝin pli ekologie amika kaj daŭrigebla opcio. Krome, kompare kun aliaj enzimoj kaj filtraj metodoj, lakazo ofertas celitan kaj kostefikan solvon sen kompromiti la produktokvaliton.
Kyomuhimbo, HD kaj Brink, HG. Aplikoj kaj senmovigigaj strategioj de kupro-entenantaj lakazoj; recenzo. Heliyon 9, e13156 (2023).
Afiŝtempo: 15-a de decembro 2025